排除故障时，请新鲜配制各种缓冲液。在使用前，将含有BSA（牛血清白蛋白）的缓冲液进行滤膜过滤除菌，并使所有试剂的温度恢复至室温。
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问题 |
可能的原因 |
建议 |
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高背景/非特异性染色 |
抗体的非特异性结合 |
更换封闭液（例如，使用酪蛋白替代BSA）；封闭结束后不要清洗；倒出封闭液，吸水纸上吸干残留液体后直接进行下一步 |
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未充分清洗酶标板 |
确保在清洗过程中每个微孔都充满缓冲液。确保清洗仪器正常工作。各步骤之间清洗3-5次。 |
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缓冲液被污染 |
新鲜配制所有缓冲液（7天内使用），并进行过滤除菌 |
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孵育温度太高 |
在整个实验过程中，应始终在室温（25度）下孵育 |
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孵育时间过长 |
缩短孵育时间 |
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酶标记物污染了底物或阳性对照污染了微孔 |
吸取不同的试剂时应更换吸头，并使用不同的贮液器。最好用移液器加入或去除清洗缓冲液 |
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检测抗体或Avidin-HRP的浓度过高 |
检查浓度计算是否正确，或进一步稀释后再用 |
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底物在使用前曝光 |
在将底物加入到微孔中以前，应始终避光保存 |
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读取吸光值时使用了错误的滤光片 |
使用推荐的酶标板时，ABTS为底物时应在405nm波长读取吸光值，并以650nm作为校正波长 |
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显色时间过长 |
每5分钟读取一次吸光值，以监测空白孔德OD读数 |
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显色弱/不显色 |
遗漏了某种试剂或某个步骤 |
查看实验方案，并严格遵循操作步骤 |
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清洗缓冲液中的去污剂浓度过高 |
去除或降低去污剂的浓度 |
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酶标板未适当清洗 |
减少各步骤之间的清洗次数，尤其是当未使用全自动或半自动洗板机时。 |
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样本中存在酶抑制剂 |
叠氮钠抑制了过氧化物酶的活性。 |
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孵育时间或温度错误 |
查看并遵循实验方案的建议 |
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加至微孔中的底物量有误 |
检查移液器 |
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酶标记物或底物无活性 |
测试它们在其他系统中的活性 |
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盒内组分的储存方法不当 |
按试剂盒说明书的要求储存各组分 |
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标准曲线不佳 |
标准品配制有误 |
根据说明书中的方法重新配制标准品 |
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过早稀释 |
各种试剂现用现配，并立即加到微孔中 |
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捕获抗体无法包板 |
使用适合ELISA的板；不能用细胞培养板 |
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清洗不充分 |
确保洗板机正常工作 |
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移液出错 |
快速、等量地将移液器中的液体沿各微孔的侧壁加入 |
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显色时间过长 |
当空白孔的OD读数不超过0.2或最高浓度标准品孔德OD读数不超过1.2时，通常能获得可靠的标准曲线 |
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盒内组分的储存方法不当 |
按试剂盒说明书的要求储存各组分 |
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精确度较差 |
试剂混合不充分 |
在移液前，确保试剂充分混匀 |
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清洗不充分 |
确保洗板机正常工作（即每个微孔中加入等体积的清洗液） |
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移液出错 |
快速、等量地将移液器中的液体沿各微孔的侧壁加入 |
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耗材的重复使用 |
吸取不同的样本时应更换吸头；不同的试剂使用不同的贮液器；各孵育时段内均用新的密封片封板 |
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微孔被吸头或洗板机划伤 |
吸液和加液时小心操作 |
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样本中存在沉淀物 |
使用前，离心样本管 |
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微孔不干净或存在污垢 |
使用前仔细检查微孔，并清除污垢。读取吸光值前，请擦拭酶标板的底部，以去除污垢或指纹。 |
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边缘效应 |
蒸发 |
在各孵育步骤均使用密封片封板 |
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温度不均匀 |
孵育期间应将酶标板放在孵育箱内，以避免出现温度波动（孵育箱的温度设置为25度）。请勿堆叠酶标板。 |
