问题 1：背景高
可能原因：
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封闭不彻底
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洗膜不充分
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抗体浓度不合适
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印记膜被污染
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曝光时间过长
解决方案：
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选择合适的封闭液，建议使用 5% 脱脂奶粉-TBST进行封闭，室温缓慢摇晃封闭1h。BSA并非合适的封闭试剂，对于磷酸化靶标，也需使用脱脂奶粉封闭。
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洗膜液中盐离子和 吐温20 的浓度是关键，两者浓度越高，洗涤越彻底。建议使用137 mM NaCl，20 mM Tris, 0.1% 吐温20 进行洗膜。建议洗膜时间为5min X 3 次。
* 洗膜时，印记膜尽量不要互相重叠，防止洗膜不彻底。
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储存已久的缓冲液、5% 脱脂牛奶等，都可能因变质而造成背景升高。
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一抗、二抗使用前仔细阅读说明书，选择合适的稀释液和稀释比，稀释倍数过高或抗体品质原因均可造成高背景。
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操作时，需全程戴手套，防止手上的油污对印记膜造成污染。
问题 2：背景有污点
可能原因：
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转膜后膜上的残留凝胶颗粒造成非特异性结合
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脱脂奶粉未完全溶解
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转膜时膜上有气泡
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抗体孵育时与膜接触不充分
解决方案：
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转膜后，将印记膜再TBST中漂洗去除残留凝胶，再进行封闭。
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脱脂奶粉与TBST充分混匀，封闭结束后将封闭液清洗干净，建议洗膜时间为5min X 3 次。
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转膜时确保将气泡排除干净。
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孵育一抗、二抗和洗膜时，确保膜充分浸润并摇晃孵育/洗膜。
* 配方赠送
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10 X TBS ：24.2g Tris Base，80g NaCl 加入 800mL ddH2O 中，混匀；调整 pH 为 7.6；加 ddH2O 定容至 1L。
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1 X TBST ：100mL 10 X TBS，加 ddH2O 稀释至 1L，加入 1mL 吐温20，混匀。
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