一、操作问题
1. 洗膜过度
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减少洗膜时间和次数；
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洗膜液中加入的去垢剂不宜过强或过多。
2. 蛋白未转到膜上
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确保转膜过程中胶与膜完全接触、转印夹层排布正确；
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用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过度；
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适当调整转膜的时间和电流，优化转印时间和电流。
3. 蛋白未完全结合到膜上
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低分子量的抗原可能会穿过转印膜，缩短转膜时间，使用小孔径的膜进行。
4. 蛋白降解
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蛋白提取时保持低温环境，并加入蛋白酶抑制剂；
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蛋白样本加入上样缓冲液后煮沸变性保存；
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样本分装保存，避免反复冻融。
5. 过度封闭
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减少封闭时间，试用不同的封闭液
6. 底物孵育时间太短
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延长底物孵育的时间
二、抗体问题
1. 一抗、二抗不匹配
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选择与一抗相匹配的二抗类型。
2. 结合目标蛋白的抗体不足
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增加抗体浓度；
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使用效价高的一抗；
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延长抗体孵育时间；
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膜充分浸润在液体中。
3. 一抗不识别目标蛋白
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参照数据库对比抗原序列和蛋白序列，选择合适的一抗。
三、抗原问题
1. 抗原不足或降解
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每条泳道上样量不低于 20~30 ug，设置阳性对照。
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封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶）。
2. 缓冲液问题
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封闭液与一抗或二抗有交叉反应；
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更换适合的封闭液。
3. ECL发光液失活或灵敏度不够
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更换发光液，选择超敏发光液。
4. 曝光时间不足
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延长曝光时间，如使用化学发光成像系统，可调整显示灰度值。
如何确定所用的细胞／组织中是否表达靶标蛋白？表达丰度如何？
查阅以下数据库：
www.biogps.org
通过mRNA表达水平给您参考估计不同样本中目的蛋白的表达水平。
www.uniprot.org
了解目的蛋白可变剪切体、蛋白表达位置、可修饰类型等。
www.phosphositeplus.org
蛋白质翻译后修饰权威数据库，查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。
